177 lines
8.0 KiB
TeX
177 lines
8.0 KiB
TeX
\item
|
|
\begin{center}
|
|
\fbox{
|
|
\begin{minipage}{0.9\textwidth}
|
|
\textbf{Szczegółowy opis sekwencji w plazmidzie pET28a(+) }
|
|
\end{minipage}
|
|
}
|
|
\end{center}
|
|
|
|
\vspace{.5cm}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item \textbf{Promotor T7}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Promotor T7 jest miejscem inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA T7, umożliwiając wysokopoziomową ekspresję genów.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(368..386)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
|
|
\item Szczegóły procesu transkrypcji:
|
|
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Ponieważ promotor T7 znajduje się na nici antysensownej (-), nić ta pełni funkcję matrycy dla procesu transkrypcji.
|
|
\item Polimeraza RNA T7 odczytuje sekwencję tej nici matrycowej (antysensownej) w kierunku 3' → 5'.
|
|
\item W wyniku transkrypcji syntetyzowane mRNA jest komplementarne do nici antysensownej i powstaje w kierunku 5' → 3'.
|
|
\item Sekwencja mRNA jest identyczna (z wyjątkiem zamiany tyminy na uracyl) z nicią sensowną (+), która koduje białko.
|
|
\end{longenum}
|
|
\item \textbf{Inne promotory i miejsca inicjacji transkrypcji:}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5' * 3'
|
|
T7 TAATACGACTCACTATAGGGAGA
|
|
T3 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
|
|
K11 AATTAGGGCACACTATAGGGAGA
|
|
SP6 ATTTACGACACACTATAGAAGAA
|
|
bind------------
|
|
-----------init
|
|
\end{verbatim}
|
|
Transkrypcja rozpoczyna się przy oznaczonym gwiazdką guaninie \cite{rong1998}.
|
|
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Operator \textit{lac}}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Operator \textit{lac} jest miejscem wiązania represora LacI, co hamuje transkrypcję w nieobecności induktora \cite{Lewis2005}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(343..367)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-AATTGTGAGCGGATAACAATT-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Miejsce wiązania rybosomu (RBS)}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item RBS jest sekwencją umożliwiającą wiązanie rybosomu i inicjację translacji.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(306..328)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-AGGAGATATACAT-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Miejsce startu translacji}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Kodon start (\texttt{ATG}) inicjuje translację białka.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(289)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-ATG-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Znaczniki His\textsubscript{6}-tag (sześciokrotny histydynowy tag)}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Znacznik His\textsubscript{6} umożliwia oczyszczanie białka za pomocą chromatografii na kolumnie niklowej \cite{Hochuli1988}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacje:}
|
|
\begin{itemize}
|
|
\item \texttt{complement(140..157)} (N-końcowy, \textbf{(-)})
|
|
\item \texttt{complement(270..287)} (C-końcowy, \textbf{(-)})
|
|
\end{itemize}
|
|
\item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{HHHHHH}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Miejsce cięcia trombiny}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Umożliwia specyficzne usunięcie znacznika His\textsubscript{6} przez enzym trombinę.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(243..260)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{LVPRGS}
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-CTGGTGCCGCGCGGCAGC-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Region terminacji T7}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Sekwencja terminacyjna zapewnia zakończenie transkrypcji przez polimerazę RNA T7 \cite{Studier1990}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(26..73)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Gen oporności na kanamycynę (Kan\textsuperscript{R})}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Koduje aminoglikozydową fosfotransferazę, zapewniając oporność na kanamycynę \cite{Reynolds1986}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{3995..4807} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYGKPDAPELFLKHGKGSVA...}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Region inicjacji replikacji (\textit{ori})}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Region \textit{ori} typu ColE1/pMB1/pBR322/pUC odpowiedzialny za replikację plazmidu \cite{Sutcliffe1978}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(3285..3873)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Gen \textit{lacI}}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Koduje represor LacI, hamujący ekspresję genów pod kontrolą operatora \textit{lac} \cite{Lewis2005}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{773..1852} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{VKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL...}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Gen \textit{rop}}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item Koduje białko Rop, stabilizujące liczbę kopii plazmidu \cite{Cesareni1982}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{2664..2852} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
|
|
\item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
VTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHADELYRSCLARFGDDGENL
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\item \textbf{Miejsce MCS (Multiple Cloning Site)}
|
|
\begin{longenum}
|
|
\item MCS zawiera wiele unikalnych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych, umożliwiając klonowanie genu \textit{dhaA}.
|
|
\item \textbf{Lokalizacja:} Obejmuje region około \texttt{complement(140..300)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
|
|
\item \textbf{Enzymy restrykcyjne i ich miejsca cięcia:}
|
|
\begin{itemize}
|
|
\item \textbf{NcoI}: \texttt{CCATGG}
|
|
\item \textbf{EcoRI}: \texttt{GAATTC}
|
|
\item \textbf{HindIII}: \texttt{AAGCTT}
|
|
\item \textbf{BamHI}: \texttt{GGATCC}
|
|
\end{itemize}
|
|
\item \textbf{Sekwencje DNA w MCS (5' $\rightarrow$ 3'):}
|
|
\begin{verbatim}
|
|
5'-GGTACCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC-3'
|
|
\end{verbatim}
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\end{longenum}
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\textbf{Wyjaśnienie orientacji nici:}
|
|
|
|
W plazmidzie pET-28a promotor T7 jest zlokalizowany na nici antysensownej (\textbf{(-)}), co oznacza, że transkrypcja zachodzi w kierunku przeciwnym do sekwencji podanej w GenBanku. W praktyce oznacza to, że gen wstawiany do MCS powinien być w orientacji zgodnej z nicią sensowną (\textbf{(+)}), aby mRNA było poprawnie syntetyzowane.
|
|
|
|
Geny \textit{lacI} i \textit{rop} są zlokalizowane na nici sensownej (\textbf{(+)}), co jest typowe dla ich funkcji w regulacji ekspresji i replikacji plazmidu. Różnice w orientacji wynikają z konstrukcji plazmidu i funkcji poszczególnych elementów genetycznych.
|
|
|
|
\vspace{0.5cm}
|
|
\textbf{Kolejne kroki:}
|
|
|
|
Dzięki powyższym informacjom możemy zaprojektować wstawienie genu dehalogenazy haloalkanowej (\textit{dhaA}) do plazmidu pET-28a, korzystając z odpowiednich miejsc restrykcyjnych w MCS i upewniając się, że gen jest wstawiony w poprawnej orientacji.
|
|
|