\newpage \item \begin{center} \fbox{ \begin{minipage}{0.9\textwidth} \textbf{Ekspresja białka dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) w \textit{E. coli} z użyciem plazmidu pET-28a.} Ekspresję białka dzikiego typu DhaA oraz jego mutantów można przeprowadzić z użyciem szczepu \textit{Escherichia coli} BL21(DE3) oraz wektora ekspresyjnego pET-28a, co umożliwia wysoką wydajność i kontrolowaną ekspresję białka \cite{studier1990use}. \end{minipage} } \end{center} \vspace{.5cm} \begin{longenum} \item Szczep \textit{Escherichia coli} BL21(DE3) \begin{longenum} \item \textbf{Genotyp}: BL21(DE3) zawiera insercję \textit{T7 RNA polymerase} pod kontrolą promotora \textit{lacUV5}, co pozwala na kontrolowaną ekspresję genów umieszczonych za promotorem \textit{T7} na plazmidach pET \cite{de1997engineering}. \item \textbf{Indukcja ekspresji}: Ekspresję można indukować za pomocą IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu), który odblokowuje promotor \textit{T7}, inicjując produkcję białka \cite{novagen1995}. \item \textbf{Zastosowania}: Dzięki niskiemu poziomowi proteaz oraz wysokiej wydajności translacji BL21(DE3) jest szeroko stosowany do ekspresji rekombinowanych białek w warunkach laboratoryjnych. \end{longenum} \vspace{0.5cm} \item Wektor pET-28a dla ekspresji białka DhaA i jego mutantów \begin{longenum} \item \textbf{Promotor T7}: pET-28a posiada promotor T7, który jest specyficznie aktywowany przez polimerazę T7, umożliwiając precyzyjną i wysoką ekspresję białka w szczepach zawierających \textit{T7 RNA polymerase} (jak BL21(DE3)) \cite{studier1990use}. \item \textbf{Znacznik His-tag}: pET-28a umożliwia fuzję białka z heksamerycznym znacznikiem histydynowym (His-tag) na końcu N- lub C-terminalnym, co ułatwia oczyszczanie białka za pomocą chromatografii na kolumnie niklowej \cite{petersen1994purification}. \item \textbf{Miejsce MCS (Multiple Cloning Site)}: Plazmid pET-28a posiada miejsce MCS, które umożliwia łatwe wstawienie genu kodującego DhaA lub jego mutanty. \item \textbf{Selekcja antybiotykowa}: pET-28a zawiera gen oporności na kanamycynę, co ułatwia selekcję kolonii \textit{E. coli} z plazmidem \cite{novagen1995}. \end{longenum} \vspace{0.5cm} \item Procedura klonowania i ekspresji \begin{longenum} \item \textbf{Klonowanie genu}: Gen kodujący białko DhaA (dzikie lub zmutowane) zostaje wstawiony do wektora pET-28a przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych i ligazy. \item \textbf{Transformacja}: Zrekombinowany plazmid jest transformowany do szczepu \textit{E. coli} BL21(DE3) za pomocą elektroporacji lub chemicznie kompetentnych komórek \cite{sambrook1989molecular}. \item \textbf{Indukcja ekspresji}: Po uzyskaniu transformantów hodowlę wprowadza się do środowiska z IPTG, co indukuje ekspresję genu pod promotorem T7. \item \textbf{Oczyszczanie białka}: Białko można łatwo oczyścić dzięki obecności znacznika His-tag za pomocą chromatografii afinacyjnej na kolumnie niklowej \cite{petersen1994purification}. \end{longenum} \end{longenum}