\item
\begin{center}
    \fbox{
        \begin{minipage}{0.9\textwidth}
            \textbf{Protokół eksperymentalny: Pomiar efektywności pracy dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) przy użyciu spektrofotometru.} 
            Eksperyment umożliwia ocenę parametrów kinetycznych enzymu, takich jak $V_{\max}$ i $K_m$, poprzez pomiar szybkości reakcji dehalogenacji halogenowanego substratu \cite{damborsky2006haloalkane}.
        \end{minipage}
    }
\end{center}

\vspace{.5cm}
\begin{longenum}
    \item Cel eksperymentu
    \begin{longenum}
        \item Ocena efektywności katalitycznej dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) poprzez pomiar szybkości dehalogenacji substratu halogenowanego \cite{stsiapanava2010characterization}.
        \item Uzyskanie parametrów kinetycznych enzymu, takich jak $V_{\max}$ i $K_m$ \cite{chowdhury2009kinetic}.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Wybór Substratu
    \begin{longenum}
        \item Przykładowy substrat: chlorometan (CH$_3$Cl) lub 1-chlorobutan, który ulega dehalogenacji przez enzym DhaA \cite{damborsky2006haloalkane}.
        \item Reakcja: 
        \[
        \mathrm{CH}_3\mathrm{Cl} \xrightarrow{\mathrm{DhaA}} \mathrm{CH}_3\mathrm{OH} + \mathrm{Cl}^-
        \]
        \item Anion chlorkowy (\(\mathrm{Cl}^-\)) tworzy produkt, którego wzrost stężenia można monitorować spektrofotometrycznie \cite{chowdhury2009kinetic}.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Przygotowanie odczynników i roztworów
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Roztwór substratu}: Przygotowany w buforze fosforanowym o pH optymalnym dla działania enzymu (zwykle pH 7-8) \cite{stsiapanava2010characterization}.
        \item \textbf{Roztwór enzymu}: Roztwór oczyszczonego enzymu DhaA w buforze, o stężeniu dostosowanym do widocznej zmiany absorbancji \cite{damborsky2006haloalkane}.
        \item \textbf{Bufor reakcyjny}: Bufor fosforanowy o odpowiednim pH dla maksymalnej aktywności enzymu.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Ustawienie Spektrofotometru
    \begin{longenum}
        \item Długość fali: Ustaw spektrofotometr na 240 nm, co odpowiada maksymalnej absorbancji anionu chlorkowego (\(\mathrm{Cl}^-\)) \cite{chowdhury2009kinetic}.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Procedura pomiarowa
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Przygotowanie próbki kontrolnej}: Zmieszaj substrat z buforem bez dodatku enzymu, aby wyeliminować absorbancję substratu.
        \item \textbf{Przygotowanie próbki badanej}:
        \begin{longenum}
            \item Do kuwety spektrofotometrycznej dodaj roztwór substratu i enzymu w buforze.
            \item Dokładnie zmieszaj i natychmiast umieść w spektrofotometrze.
        \end{longenum}
        \item \textbf{Pomiar absorbancji}:
        \begin{longenum}
            \item Mierz zmianę absorbancji co 15 sekund przez okres 5-10 minut.
            \item Monitoruj zmniejszanie absorbancji substratu lub wzrost absorbancji produktu (anionu chlorkowego) \cite{chowdhury2009kinetic}.
        \end{longenum}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Obliczenia
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Szybkość reakcji}: Oblicz początkową szybkość reakcji ($V_0$) jako zmianę absorbancji w jednostce czasu ($\Delta A/\Delta t$) \cite{chowdhury2009kinetic}.
        \item \textbf{Parametry $V_{\max}$ i $K_m$}: Dla różnych stężeń substratu wykonaj wykres Lineweavera-Burka lub krzywą Michaelisa-Menten w celu obliczenia $V_{\max}$ i $K_m$.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Interpretacja wyników
    \begin{longenum}
        \item Wyższe $V_{\max}$ oznacza wyższą maksymalną szybkość reakcji, a niższe $K_m$ wskazuje na wyższe powinowactwo enzymu do substratu \cite{stsiapanava2010characterization}.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Kontrole i powtarzalność
    \begin{longenum}
        \item Powtórz eksperyment dla różnych stężeń enzymu i w różnych warunkach pH oraz temperatury, aby ocenić stabilność i optymalne warunki aktywności enzymu \cite{damborsky2006haloalkane}.
    \end{longenum}
\end{longenum}

