\newpage
\item
\begin{center}
    \fbox{
        \begin{minipage}{0.9\textwidth}
            \textbf{Ekspresja białka dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) w \textit{E. coli} z użyciem plazmidu pET-28a.} 
            Ekspresję białka dzikiego typu DhaA oraz jego mutantów można przeprowadzić z użyciem szczepu \textit{Escherichia coli} BL21(DE3) oraz wektora ekspresyjnego pET-28a, co umożliwia wysoką wydajność i kontrolowaną ekspresję białka \cite{studier1990use}.
        \end{minipage}
    }
\end{center}

\vspace{.5cm}
\begin{longenum}
    \item Szczep \textit{Escherichia coli} BL21(DE3)
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Genotyp}: BL21(DE3) zawiera insercję \textit{T7 RNA polymerase} pod kontrolą promotora \textit{lacUV5}, co pozwala na kontrolowaną ekspresję genów umieszczonych za promotorem \textit{T7} na plazmidach pET \cite{de1997engineering}.
        \item \textbf{Indukcja ekspresji}: Ekspresję można indukować za pomocą IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu), który odblokowuje promotor \textit{T7}, inicjując produkcję białka \cite{novagen1995}.
        \item \textbf{Zastosowania}: Dzięki niskiemu poziomowi proteaz oraz wysokiej wydajności translacji BL21(DE3) jest szeroko stosowany do ekspresji rekombinowanych białek w warunkach laboratoryjnych.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Wektor pET-28a dla ekspresji białka DhaA i jego mutantów
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Promotor T7}: pET-28a posiada promotor T7, który jest specyficznie aktywowany przez polimerazę T7, umożliwiając precyzyjną i wysoką ekspresję białka w szczepach zawierających \textit{T7 RNA polymerase} (jak BL21(DE3)) \cite{studier1990use}.
        \item \textbf{Znacznik His-tag}: pET-28a umożliwia fuzję białka z heksamerycznym znacznikiem histydynowym (His-tag) na końcu N- lub C-terminalnym, co ułatwia oczyszczanie białka za pomocą chromatografii na kolumnie niklowej \cite{petersen1994purification}.
        \item \textbf{Miejsce MCS (Multiple Cloning Site)}: Plazmid pET-28a posiada miejsce MCS, które umożliwia łatwe wstawienie genu kodującego DhaA lub jego mutanty.
        \item \textbf{Selekcja antybiotykowa}: pET-28a zawiera gen oporności na kanamycynę, co ułatwia selekcję kolonii \textit{E. coli} z plazmidem \cite{novagen1995}.
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item Procedura klonowania i ekspresji
    \begin{longenum}
        \item \textbf{Klonowanie genu}: Gen kodujący białko DhaA (dzikie lub zmutowane) zostaje wstawiony do wektora pET-28a przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych i ligazy.
        \item \textbf{Transformacja}: Zrekombinowany plazmid jest transformowany do szczepu \textit{E. coli} BL21(DE3) za pomocą elektroporacji lub chemicznie kompetentnych komórek \cite{sambrook1989molecular}.
        \item \textbf{Indukcja ekspresji}: Po uzyskaniu transformantów hodowlę wprowadza się do środowiska z IPTG, co indukuje ekspresję genu pod promotorem T7.
        \item \textbf{Oczyszczanie białka}: Białko można łatwo oczyścić dzięki obecności znacznika His-tag za pomocą chromatografii afinacyjnej na kolumnie niklowej \cite{petersen1994purification}.
    \end{longenum}
\end{longenum}

