80 lines
4.1 KiB
TeX
80 lines
4.1 KiB
TeX
|
\item
|
||
|
|
\begin{center}
|
||
|
|
\fbox{
|
||
|
|
\begin{minipage}{0.9\textwidth}
|
||
|
|
\textbf{Protokół eksperymentalny: Pomiar efektywności pracy dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) przy użyciu spektrofotometru.}
|
||
|
|
Eksperyment umożliwia ocenę parametrów kinetycznych enzymu, takich jak $V_{\max}$ i $K_m$, poprzez pomiar szybkości reakcji dehalogenacji halogenowanego substratu \cite{damborsky2006haloalkane}.
|
||
|
|
\end{minipage}
|
||
|
|
}
|
||
|
|
\end{center}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{.5cm}
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Cel eksperymentu
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Ocena efektywności katalitycznej dehalogenazy haloalkanowej (DhaA) poprzez pomiar szybkości dehalogenacji substratu halogenowanego \cite{stsiapanava2010characterization}.
|
||
|
|
\item Uzyskanie parametrów kinetycznych enzymu, takich jak $V_{\max}$ i $K_m$ \cite{chowdhury2009kinetic}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Wybór Substratu
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Przykładowy substrat: chlorometan (CH$_3$Cl) lub 1-chlorobutan, który ulega dehalogenacji przez enzym DhaA \cite{damborsky2006haloalkane}.
|
||
|
|
\item Reakcja:
|
||
|
|
\[
|
||
|
|
\mathrm{CH}_3\mathrm{Cl} \xrightarrow{\mathrm{DhaA}} \mathrm{CH}_3\mathrm{OH} + \mathrm{Cl}^-
|
||
|
|
\]
|
||
|
|
\item Anion chlorkowy (\(\mathrm{Cl}^-\)) tworzy produkt, którego wzrost stężenia można monitorować spektrofotometrycznie \cite{chowdhury2009kinetic}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Przygotowanie odczynników i roztworów
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item \textbf{Roztwór substratu}: Przygotowany w buforze fosforanowym o pH optymalnym dla działania enzymu (zwykle pH 7-8) \cite{stsiapanava2010characterization}.
|
||
|
|
\item \textbf{Roztwór enzymu}: Roztwór oczyszczonego enzymu DhaA w buforze, o stężeniu dostosowanym do widocznej zmiany absorbancji \cite{damborsky2006haloalkane}.
|
||
|
|
\item \textbf{Bufor reakcyjny}: Bufor fosforanowy o odpowiednim pH dla maksymalnej aktywności enzymu.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Ustawienie Spektrofotometru
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Długość fali: Ustaw spektrofotometr na 240 nm, co odpowiada maksymalnej absorbancji anionu chlorkowego (\(\mathrm{Cl}^-\)) \cite{chowdhury2009kinetic}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Procedura pomiarowa
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item \textbf{Przygotowanie próbki kontrolnej}: Zmieszaj substrat z buforem bez dodatku enzymu, aby wyeliminować absorbancję substratu.
|
||
|
|
\item \textbf{Przygotowanie próbki badanej}:
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Do kuwety spektrofotometrycznej dodaj roztwór substratu i enzymu w buforze.
|
||
|
|
\item Dokładnie zmieszaj i natychmiast umieść w spektrofotometrze.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
\item \textbf{Pomiar absorbancji}:
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Mierz zmianę absorbancji co 15 sekund przez okres 5-10 minut.
|
||
|
|
\item Monitoruj zmniejszanie absorbancji substratu lub wzrost absorbancji produktu (anionu chlorkowego) \cite{chowdhury2009kinetic}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Obliczenia
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item \textbf{Szybkość reakcji}: Oblicz początkową szybkość reakcji ($V_0$) jako zmianę absorbancji w jednostce czasu ($\Delta A/\Delta t$) \cite{chowdhury2009kinetic}.
|
||
|
|
\item \textbf{Parametry $V_{\max}$ i $K_m$}: Dla różnych stężeń substratu wykonaj wykres Lineweavera-Burka lub krzywą Michaelisa-Menten w celu obliczenia $V_{\max}$ i $K_m$.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Interpretacja wyników
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Wyższe $V_{\max}$ oznacza wyższą maksymalną szybkość reakcji, a niższe $K_m$ wskazuje na wyższe powinowactwo enzymu do substratu \cite{stsiapanava2010characterization}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|
||
|
|
\vspace{0.5cm}
|
||
|
|
\item Kontrole i powtarzalność
|
||
|
|
\begin{longenum}
|
||
|
|
\item Powtórz eksperyment dla różnych stężeń enzymu i w różnych warunkach pH oraz temperatury, aby ocenić stabilność i optymalne warunki aktywności enzymu \cite{damborsky2006haloalkane}.
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
\end{longenum}
|
||
|
|
|