pfas/doc/modules/pet28a.tex

\item
\begin{center}
    \fbox{
        \begin{minipage}{0.9\textwidth}
            \textbf{Szczegółowy opis sekwencji w plazmidzie pET28a(+) }
        \end{minipage}
    }
\end{center}

\vspace{.5cm}
\begin{longenum}
\item \textbf{Promotor T7}
    \begin{longenum}
        \item Promotor T7 jest miejscem inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA T7, umożliwiając wysokopoziomową ekspresję genów.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(368..386)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
        \end{verbatim}

        \item Szczegóły procesu transkrypcji:

        \begin{longenum}
            \item Ponieważ promotor T7 znajduje się na nici antysensownej (-), nić ta pełni funkcję matrycy dla procesu transkrypcji.
            \item Polimeraza RNA T7 odczytuje sekwencję tej nici matrycowej (antysensownej) w kierunku 3' → 5'.
            \item W wyniku transkrypcji syntetyzowane mRNA jest komplementarne do nici antysensownej i powstaje w kierunku 5' → 3'.
            \item Sekwencja mRNA jest identyczna (z wyjątkiem zamiany tyminy na uracyl) z nicią sensowną (+), która koduje białko.
        \end{longenum}    
        \item \textbf{Inne promotory i miejsca inicjacji transkrypcji:}
        \begin{verbatim}
        5'                       *          3'
        T7   TAATACGACTCACTATAGGGAGA
        T3   AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
        K11  AATTAGGGCACACTATAGGGAGA
        SP6  ATTTACGACACACTATAGAAGAA
           bind------------
                        -----------init
        \end{verbatim}
        Transkrypcja rozpoczyna się przy oznaczonym gwiazdką guaninie \cite{rong1998}.

    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Operator \textit{lac}}
    \begin{longenum}
        \item Operator \textit{lac} jest miejscem wiązania represora LacI, co hamuje transkrypcję w nieobecności induktora \cite{Lewis2005}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(343..367)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-AATTGTGAGCGGATAACAATT-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Miejsce wiązania rybosomu (RBS)}
    \begin{longenum}
        \item RBS jest sekwencją umożliwiającą wiązanie rybosomu i inicjację translacji.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(306..328)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-AGGAGATATACAT-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Miejsce startu translacji}
    \begin{longenum}
        \item Kodon start (\texttt{ATG}) inicjuje translację białka.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(289)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-ATG-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Znaczniki His\textsubscript{6}-tag (sześciokrotny histydynowy tag)}
    \begin{longenum}
        \item Znacznik His\textsubscript{6} umożliwia oczyszczanie białka za pomocą chromatografii na kolumnie niklowej \cite{Hochuli1988}.
        \item \textbf{Lokalizacje:}
        \begin{itemize}
            \item \texttt{complement(140..157)} (N-końcowy, \textbf{(-)})
            \item \texttt{complement(270..287)} (C-końcowy, \textbf{(-)})
        \end{itemize}
        \item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{HHHHHH}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Miejsce cięcia trombiny}
    \begin{longenum}
        \item Umożliwia specyficzne usunięcie znacznika His\textsubscript{6} przez enzym trombinę.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(243..260)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{LVPRGS}
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-CTGGTGCCGCGCGGCAGC-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Region terminacji T7}
    \begin{longenum}
        \item Sekwencja terminacyjna zapewnia zakończenie transkrypcji przez polimerazę RNA T7 \cite{Studier1990}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(26..73)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Sekwencja DNA (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Gen oporności na kanamycynę (Kan\textsuperscript{R})}
    \begin{longenum}
        \item Koduje aminoglikozydową fosfotransferazę, zapewniając oporność na kanamycynę \cite{Reynolds1986}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{3995..4807} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
        \item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYGKPDAPELFLKHGKGSVA...}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Region inicjacji replikacji (\textit{ori})}
    \begin{longenum}
        \item Region \textit{ori} typu ColE1/pMB1/pBR322/pUC odpowiedzialny za replikację plazmidu \cite{Sutcliffe1978}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{complement(3285..3873)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Gen \textit{lacI}}
    \begin{longenum}
        \item Koduje represor LacI, hamujący ekspresję genów pod kontrolą operatora \textit{lac} \cite{Lewis2005}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{773..1852} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
        \item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:} \texttt{VKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL...}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Gen \textit{rop}}
    \begin{longenum}
        \item Koduje białko Rop, stabilizujące liczbę kopii plazmidu \cite{Cesareni1982}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} \texttt{2664..2852} (na nici sensownej, \textbf{(+)})
        \item \textbf{Sekwencja aminokwasowa:}
        \begin{verbatim}
        VTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHADELYRSCLARFGDDGENL
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

    \vspace{0.5cm}
    \item \textbf{Miejsce MCS (Multiple Cloning Site)}
    \begin{longenum}
        \item MCS zawiera wiele unikalnych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych, umożliwiając klonowanie genu \textit{dhaA}.
        \item \textbf{Lokalizacja:} Obejmuje region około \texttt{complement(140..300)} (na nici antysensownej, \textbf{(-)})
        \item \textbf{Enzymy restrykcyjne i ich miejsca cięcia:}
        \begin{itemize}
            \item \textbf{NcoI}: \texttt{CCATGG}
            \item \textbf{EcoRI}: \texttt{GAATTC}
            \item \textbf{HindIII}: \texttt{AAGCTT}
            \item \textbf{BamHI}: \texttt{GGATCC}
        \end{itemize}
        \item \textbf{Sekwencje DNA w MCS (5' $\rightarrow$ 3'):}
        \begin{verbatim}
        5'-GGTACCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC-3'
        \end{verbatim}
    \end{longenum}

\end{longenum}

\vspace{0.5cm}
\textbf{Wyjaśnienie orientacji nici:}

W plazmidzie pET-28a promotor T7 jest zlokalizowany na nici antysensownej (\textbf{(-)}), co oznacza, że transkrypcja zachodzi w kierunku przeciwnym do sekwencji podanej w GenBanku. W praktyce oznacza to, że gen wstawiany do MCS powinien być w orientacji zgodnej z nicią sensowną (\textbf{(+)}), aby mRNA było poprawnie syntetyzowane.

Geny \textit{lacI} i \textit{rop} są zlokalizowane na nici sensownej (\textbf{(+)}), co jest typowe dla ich funkcji w regulacji ekspresji i replikacji plazmidu. Różnice w orientacji wynikają z konstrukcji plazmidu i funkcji poszczególnych elementów genetycznych.

\vspace{0.5cm}
\textbf{Kolejne kroki:}

Dzięki powyższym informacjom możemy zaprojektować wstawienie genu dehalogenazy haloalkanowej (\textit{dhaA}) do plazmidu pET-28a, korzystając z odpowiednich miejsc restrykcyjnych w MCS i upewniając się, że gen jest wstawiony w poprawnej orientacji.